操作簡單

與傳統(tǒng)酶切連接比較，單次酶切連接只能連接一個片段，而無縫克隆單次反應能完成一個至多個片段的克隆。

無縫克隆與酶切連接相比，沒有酶切處理的過程，插入片段和線性載體可通過PCR擴增(或酶切)進行制備，并且只需要將重組體系在50 ℃處理15-60min，即可進行轉(zhuǎn)化。

無縫克隆不受限于限制性內(nèi)切酶位點，可以在載體的任何位置插入目的片段。

無縫克隆陽性率高于傳統(tǒng)的酶切連接方法。

實驗周期短

無縫克隆與酶切連接相比，沒有酶切處理的過程，實驗周期更短。

酶切連接為了提高連接效率，通常需要連接處理1h甚至更久，無縫克隆只需要將重組體系在50 ℃處理15-60 min，即可進行轉(zhuǎn)化。

可實現(xiàn)多種應用

根據(jù)實驗目的，無縫克隆可以進行快速克隆、高通量克隆、無縫克隆、DNA定點突變和長轉(zhuǎn)錄本克隆等。

2×Seamless Cloning Premix無縫克隆試劑盒可一次實現(xiàn)多至5個插入片段的無縫克隆，克隆數(shù)量多，陽性率高(>95%)。

不同數(shù)量片段重組效率

圖2 不同數(shù)量片段同源重組后的單克隆數(shù)

陽性率

圖3 不同數(shù)量片段同源重組后菌落PCR驗證

A：載體與單片段重組克隆驗證；

B：載體與3片段重組克隆驗證；

C：載體與4片段重組克隆驗證；

D：載體與5片段重組克隆驗證。

平板上無轉(zhuǎn)化子或數(shù)量很少

引物設計不正確：引物應包含15-25 bp同源臂，GC含量在40-60%之間。

組裝體系比例不合適：按照說明書推薦用量進行配置，線性載體和片段加入過多或過少均會對重組效果有影響。

線性載體和片段不純：核酸純度過低會影響重組效果，可提高線性載體和片段濃度。

感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率低：感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率應大于10?cfu/μg。

多數(shù)克隆不含插入片段或含有不正確的插入片段

PCR產(chǎn)物含有非特異性擴增產(chǎn)物：優(yōu)化PCR擴增體系，提高特異性；膠回收PCR擴增產(chǎn)物，回收單一片段；對更多轉(zhuǎn)化子進行鑒定。

擴增模板處理不徹底：轉(zhuǎn)化時設置陰性對照，驗證酶切或擴增產(chǎn)物是否線性化完全；優(yōu)化酶切體系，增加酶切酶用量或酶切時間。