3分鐘！了解限制性核酸內(nèi)切酶在mRNA藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用

2023-08-11 09:44:00

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前言

限制性核酸內(nèi)切酶是用來識別特定的脫氧核苷酸序列，并對每條鏈中特定部位的兩個脫氧核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵進行切割的一類酶。在分子生物學(xué)研究中，限制性核酸內(nèi)切酶廣泛應(yīng)用于DNA基因組物理圖譜的組建、基因的定位和基因分離、DNA分子堿基序列分析、相關(guān)DNA分子和遺傳工程、基因工程編輯。

在過去的幾年里，mRNA疫苗和基因治療產(chǎn)業(yè)化得到了快速發(fā)展，新冠mRNA疫苗的上市極速推動了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。實際情況的緊迫需求以及 mRNA技術(shù)自身無限的臨床應(yīng)用前景都使得mRNA在生物行業(yè)舉足輕重。mRNA疫苗屬于第三代疫苗，本質(zhì)為核酸疫苗。經(jīng)優(yōu)化設(shè)計的外源mRNA導(dǎo)入細胞后可利用胞內(nèi)的蛋白組裝系統(tǒng)進行翻譯，從而產(chǎn)生相應(yīng)的抗原，激活免疫系統(tǒng)。

mRNA規(guī)?；a(chǎn)主要依靠體外轉(zhuǎn)錄，一段DNA模板在RNA 聚合酶的作用下利用NTP為底物進行酶促反應(yīng)，1μg的DNA模板通常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量能達到100-200μg左右。在此過程中，DNA模板作為重要的信息載體承擔(dān)重要的任務(wù)。盡管目前市面上推出類似“一鍋法”mRNA制備工藝，但DNA作為mRNA生產(chǎn)過程中的中間品，對批間穩(wěn)定性，工藝穩(wěn)定性等方面的研究仍有不可替代的作用。

用作轉(zhuǎn)錄的DNA模板通常由兩種方式制備，首先是PCR的方式，引物設(shè)計通常會選擇在T7啟動子上游和poly(A)模板下游，以得到一段帶有T7啟動子的模板序列。這種采用擴增的方式制備DNA模板在研究階段尚可行，受限于PCR復(fù)雜的溫度控制，PCR制備模板的方式在mRNA的工業(yè)生產(chǎn)中用途有限。

PCR擴增制備體外轉(zhuǎn)錄模版位點示意

限制性內(nèi)切酶制備體外轉(zhuǎn)錄模版位點示意

得益于基因治療的發(fā)展，質(zhì)粒的工業(yè)化生產(chǎn)至今已有數(shù)十年的歷史，發(fā)展相對成熟。研究者發(fā)現(xiàn)將質(zhì)粒作為mRNA工業(yè)化生產(chǎn)的模板具有先天優(yōu)勢。借助于基因治療中質(zhì)粒的發(fā)展和純化工藝，能迅速得到合格的用于mRNA生產(chǎn)的質(zhì)粒。

基因治療中使用的質(zhì)粒通常具有閉合環(huán)狀的超螺旋結(jié)構(gòu)。在mRNA制備過程中，借助于質(zhì)粒中的T7啟動子，RNA聚合酶能高效地轉(zhuǎn)錄T7下游的序列。體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的終止發(fā)生時往往通過依賴ρ因子和不依賴ρ因子的方式進行，而體外轉(zhuǎn)錄受限于質(zhì)粒的特殊結(jié)構(gòu)，往往需要人為制造轉(zhuǎn)錄的終止位點。

出于穩(wěn)定性和免疫原性考慮，mRNA的模板設(shè)計通常需要在3'添加長度為70-110的poly(A)序列，因此轉(zhuǎn)錄終止的位點往往限定在緊鄰poly (A)序列的末尾，而限制性內(nèi)切酶成為首選，此過程被稱為質(zhì)粒模板線性化。

使用限制性內(nèi)切酶制備mRNA轉(zhuǎn)錄模板具有以下優(yōu)勢：

適合工藝放大

使用限制性內(nèi)切酶進行模板的制備只需要在純化質(zhì)粒的基礎(chǔ)上增加酶切的過程，隨后利用上游質(zhì)粒的純化平臺再次進行線性化模板的回收。根據(jù)實際需要，酶切體系較為容易放大，在mRNA的工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，往往借助生物反應(yīng)器實現(xiàn)此過程。

不受序列影響

限制性內(nèi)切酶種類極為豐富，用于質(zhì)粒模板線性化的限制性內(nèi)切酶有多種選擇，因此，使用限制性內(nèi)切酶進行線性化模板的制備時能夠不受內(nèi)部序列的影響，可以靈活選擇不同限制性內(nèi)切酶。

不會額外引入其他復(fù)雜雜質(zhì)

酶切反應(yīng)體系簡單，成分清楚，反應(yīng)完成后，只需要進行簡單的層析即可有效除去反應(yīng)產(chǎn)物中的蛋白分子以及各種小離子，經(jīng)過初步純化后的酶切產(chǎn)物，其純度基本已達到下游轉(zhuǎn)錄實驗的要求。

用于mRNA制備的限制性內(nèi)切酶與普通限制性內(nèi)切酶的差異：

高效穩(wěn)定

質(zhì)粒模板的線性化在整個mRNA的生產(chǎn)過程中雖然是相對簡單的一步，但線性化模板的質(zhì)量直接決定了下游轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的質(zhì)量，因此選擇一款高效、穩(wěn)定的限制性內(nèi)切酶尤為重要，這也對限制性內(nèi)切酶在批次、存儲方面的穩(wěn)定性有了更高的要求。

無動物源配方和生產(chǎn)過程

由于GMP級輔料具有嚴格的質(zhì)量要求，因此，在內(nèi)切酶生產(chǎn)中，從菌體培養(yǎng)發(fā)酵，到酶原液制備，均使用無動物源試劑和輔料，所配套使用的反應(yīng)緩沖液在配制過程中也使用無動物源類試劑。

避免產(chǎn)生 3'突出末端

用于制備線性化模版的限制性內(nèi)切酶通常識別位點位于切割位點之外，因此，通過序列設(shè)計，改造完成的質(zhì)粒在使用這類限制酶切割時，可產(chǎn)生帶有完整且單獨的poly(A)結(jié)構(gòu)，對下游mRNA的穩(wěn)定性更加有利，且消除了poly(A)后多余序列的影響。此外，3'突出末端序列可增加副產(chǎn)物dsRNA的產(chǎn)生，增加mRNA產(chǎn)物的免疫原性，對后續(xù)的給藥臨床階段帶來困難。

盡可能選擇反應(yīng)溫度為37℃的酶

對于工業(yè)化生產(chǎn)，溫度控制是一項比較繁瑣的過程，大多數(shù)生物反應(yīng)因為酶的參與需要在37℃進行。某些特殊的限制性內(nèi)切酶要求更高的溫度，實質(zhì)上，此類限制性內(nèi)切酶并不適用于工藝放大，因此在內(nèi)切酶的選擇上，盡可能選擇反應(yīng)溫度在37℃的酶，更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。